1、梯度洗脱的原理是什么？
①梯度洗脱是指在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，达到有效分离的洗脱方式。梯度洗脱一般采用二元流动相，通常为水相和有机相。
②梯度洗脱时流动相通常由多种不同极性的溶剂组成。梯度洗脱主要原理是通过调整不同时间段流动相的极性来调节各个组分的容量因子K，使得在合适的时间范围内将各个组分的保留合理分配，最终实现最佳分离。
2、影响出峰时间的因素有哪些？
①流动相的pH值主要是影响到分配系数而导致各组分出峰时间的不同。
②除此之外，影响出峰时间的因素还有很多，从分配系数、容量因子等各个方面考虑，除了与目标化合物在固定相和流动相中的分配性质有关，还与流速，压力，柱温等液相色谱仪参数有关，具体涉及下面几种因素的影响：
a、目标化合物本身，具体包括分子量、结构、化合物类型、极性等；
b、流动相，具体包括流动相构成、配比、流动相各组分极性，洗脱方式，流速等；
c、固定相，具体包括固定相种类、结构、色谱柱长度等；
d、分配系数与容量因子，具体包括化合物在流动相与固定相之间的分配情况，柱温等。
3、怎样将目标物的保留时间提前？
问题描述：用液相色谱仪做某物质含量测定时，保留时间太长，20min左右才出峰，有没什么方法可以将保留时间提前？
可以从通过改变目标组分容量因子K、缩短柱长、增加柱温等方式将保留时间提前，具体可以采取以下方法：
①调整流动相，具体包括调整流动相构成、配比、流动相各组分极性、洗脱方式、提高流速等。
②调整固定相，具体包括固定相种类、结构、缩短色谱柱长度等。
③增加柱温，降低流动相传质阻力等。
4、如何计算溶剂强度(容量因子)K？
①容量因子指在一定温度和压力下组分在两相中分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。容量因子反映了组分在柱中的迁移速率，又称作分配比，用符号K表示。
②在容量因子的具体计算公式中，需要注意的是，容量因子与分配系数不同，容量因子除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm有关。由于t’R、tm较Vs、Vm易于测定，所以容量因子应用更广泛。
5、怎样改变流动相比例来延长保留时间？
问题描述：采用C18柱测定黄酮苷，用甲醇+乙腈+四氢呋喃+醋酸(1:1:19.4:78.6)溶液做流动相，分离效果不理想，想通过延长保留时间的方式提高分离度，具体应该如何操作？
①甲醇+乙腈+四氢呋喃+醋酸(1:1:19.4:78.6)溶液做流动相，流动相的pH值可能会超过色谱柱的耐受范围，因此不建议使用。建议直接使用甲醇-水或是乙腈-水作为流动相，水相中可以适当加点甲酸或是乙酸来得到最佳分离效果。
②通常可以通过降低流速、减小有机相比例、调节流动相pH值或更换较长的色谱柱等方式延长待测组分的保留时间，从而达到提高组分之间分离度的目的。
6、为什么保留时间总在变化？
问题描述：采用高效液相色谱仪分析苯甲酸时，流动相走了很久，进样以后保留时间还是不断漂移，是什么原因造成的？
保留时间一直在变，说明系统没有平衡好，可以从多个方面去排查原因。
①流动相可能是最主要的原因，流动相平衡时间是否充足、管路有没有气泡、流动相中有机相是否蒸发、比例阀工作是否正常。
②泵有可能存在问题，输液是否正常、压力是否稳定、泵密封垫是否完好、是否有漏点。
③色谱柱也需要排查，是否恒温、是否有漏液。
7、什么是液相色谱的基线？
①当色谱柱中仅有流动相通过时，检测器所产生的响应信号的曲线。
②稳定的基线应该是一条接近于水平的直线，反应的是随着时间变化的检测器系统噪声值。
8、分离度应大于1.5是指什么？
①分离度是衡量色谱柱分离效果的指标，它表示相邻组分色谱峰的分离情况，具体为相邻组分色谱峰保留值tRI，tRII之差与两峰宽WI，WII平均宽度之比，用符号R表示。
②两峰间距离越大，两峰越窄，R值就越大，分离的就越好。当R=1时，两色谱峰交叠约4%，可称为基本分离；当R=1.5时，两色谱峰交叠约0.3%，可视为相邻两组分完全分离。
③分离度要求大于1.5，那就是说要求两种组分完全分离。
9、检出限和定量限有什么区别？
问题描述：什么是检出限？什么是定量限？两者有什么区别？
①两者的定义如下：
a、检出限(LOD，Limit of Detection)：分析方法在规定实验条件下所能检出被测组分的最低浓度或最低量；
b、定量限(LOQ，Limit of Quantification)：分析方法可定量测定样品中待测组分的最低浓度或最低量。
②两者的区别如下：
a、检出限指试样在确定的实验条件下，被测物能被检测出的最低浓度或含量。它是限度检验效能指标，无需定量测定，只要指出高于或低于该规定浓度即可。
b、定量限指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度要求。
c、检出限或定量限的测定通常是在目标物的含量接近于“零”的时候才需要进行测定。当方法应用于所测定的分析物浓度要比定量限大的多时，检出限与定量限评定就显的不是非常有必要了。但是对于那些浓度接近于检出限与定量限的痕量和超痕量测试，常报出“未检出”时，这时检出限或定量限对于风险评估或法规决策则就显得非常的重要。
d、不同的基体需要独立评估其检出限和定量限。
e、通常3倍信噪比是检出限，10倍信噪比是定量限，但是不同的领域有不同的规定，测定检出限和定量限的方法也不一样。
10、如何获得检出限？
问题描述：如何获得检出限？有没有参考标准？
①可用多种方式获得检出限，昌晖仪表罗列了一些常见的获得检出限的方法。
a、基于虚拟(Visual)评估LOD：
Visual评估可应用于非仪器方法和仪器分析方法，同时也可应用于定性测试方法的评估。通过往样品空白中添加已经浓度待测物质进行分析，评定能够可靠被检测出的最低浓度值。
在样品空白中加入一系列不同浓度的分析物，在每一个浓度点需要进行约7次的独立测试。各个浓度点的重复性测试应该随机。对于定性分析，通过绘制阳性百分比(阴性)与浓度之间的响应曲线，检查确定哪个浓度阈值是不可靠的。
b、空白标准偏差进行评定LOD
通过分析大量的空白进行评定(推荐20个以上)。样品空白独立测试的次数(n大于10以上)，以及加入最低可接受浓度的样品空白测试次数(n大于10次以上)。LOD的评定可用样品空白平均值加上3倍标准偏差。
c、基于校准曲线的LOD评定
如果LOD数据或与LOD相近的数据无法得到，则可利用校准曲线的参数进行评估。用空白加上空白的3倍偏差，仪器对于空白的响应可用方程截距a表示，仪器响应的标准偏差可用校准曲线的标准偏差Sy/x来表示。故可利用方程yLOD=a+3Sy/x=a+bxLOD，则xLOD=3Sy/x/b。这个方程广泛应用于分析化学。然而由于这是推断，当浓度接近于期望LOD时，则所测定的数据就会显得不那么可靠，建议当浓度接近于LOD时，需要证明要在合适的置信区间内能够被测定出来(可靠地被测定出来)。
d、基于信噪比LOD
由于仪器分析过程都会有背景噪声，常用的方法就是利用已经低浓度的分析物与空白样品的测量信号进行比较，确定出能够可靠测定出的最小浓度，最典型的可接受的信噪比是2：1或3：1。
②不同领域，获得检出限的依据不一样，下面罗列了部分参考依据。
a、GB/T 27417-2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》；
b、JJG 705-2014《液相色谱仪》；
c、HJ 168-2010《环境监测 分析方法标准制修订技术导则》；
d、GBZ/T 210.4-2008《职业卫生标准制定指南 第4部分：工作场所空气中化学物质的测定方法》。
